V procesu provádění genetických studií se často setkáváme s nedostatečnými vzorky RNA, například pro studium drobných anatomických nádorů ústní dutiny, dokonce i jednobuněčných vzorků a vzorků specifických genových mutací, které jsou v lidských buňkách přepisovány na velmi nízkých úrovních.Samozřejmě, že u testu na COVID-19, pokud tampony nebudou na správném místě nebo nebudou během odběru dostatečně často, bude velikost vzorku velmi malá, a proto Komise pro zdraví a plánování rodiny vyšla před dvěma dny a prošel testem, a pokud vzorkovač nukleových kyselin neodebral šest vzorků, můžete to nahlásit.
Citlivost činidla je důležitá, protože máme ten či onen problém, takže co můžeme udělat pro zlepšení citlivosti RT-PCR?
Než probereme možná řešení, zmiňme dvě velké komplikace se situací, kterou jsme právě zmínili.
Za prvé se obáváme ztráty RNA, když máme v našem vzorku jen několik buněčných populací.Pokud se použijí tradiční separační a čisticí metody, jako je kolonová metoda nebo metoda srážení nukleových kyselin, existuje vysoká pravděpodobnost, že se těch několik vzorků ztratí.Jedním z řešení je přidat molekulu nosiče, jako je tRNA, ale ani potom neexistuje žádná záruka, že náš experiment s obnovou je v pořádku.
Jaký je tedy lepší způsob?Dobrou volbou pro kultivované buňky nebo mikroanatomické vzorky je použití přímé lýzy.
Cílem je rozdělit buňky na 5 minut, uvolnit RNA do roztoku, poté zastavit reakci na 2 minuty, poté přidat lyzát přímo do reakce reverzní transkripce, aby nedošlo ke ztrátě RNA, a nakonec přímo vložit výslednou cDNA do reakce v reálném čase.
Ale co když kvůli omezenému výchozímu bodu nebo malému množství exprese cílového genu můžeme recyklovat veškerou RNA a přesto neposkytnout dostatek templátů pro získání dobrého signálu v reálném čase?
V tomto případě může být krok předamplifikace velmi užitečný.
Následuje schéma pro zvýšení citlivosti po reverzní transkripci.Než začneme, musíme se po proudu zeptat, o které cíle máme zájem, abychom pro tyto cíle navrhli specifické primery pro předamplifikaci.
Toho lze dosáhnout vytvořením smíšeného primeru s až 100 páry primerů a 10 až 14násobným reakčním cyklem.Proto je k předamplifikaci získané cDNA zapotřebí Master Mix speciálně navržený pro tento požadavek.
Důvodem nastavení počtu cyklů mezi 10 a 14 je to, že tento omezený počet cyklů zajišťuje náhodnost mezi různými cíli, což je klíčové pro výzkumníky, kteří potřebují kvantitativní molekulární informace.
Po preamplifikaci můžeme získat velké množství cDNA, takže citlivost detekce na back-endu se výrazně zlepší a můžeme dokonce naředit vzorek a provést více reakcí PCR v reálném čase, abychom eliminovali možné náhodné chyby.
Čas odeslání: duben-11-2023